کروماتوگرافی با کارایی بالا (HPLC)

  • ۱۳۹۸/۰۴/۱۴
  • 58 بازدید
  • ادمین کل

کروماتوگرافی با کارایی بالا

High performance liquid chromatography, HPLC



چکیده

کروماتوگرافی (chromatography) یک تکنیک برای جداسازی (separation) و خالص‌­سازی مخلوط­‌هاست؛ اما عمدتاً برای تعیین ترکیب شیمیایی یک نمونه (آنالیت، analyte) و شناسایی اجزای آن به کار می‌­رود. این روش دارای دقتی بالا و کاربردهای فراوان در زمینه‌­های مختلف (نظیر مهندسی، پزشکی، کشاورزی و...) است. کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (high pressure liquid chromatography, HPLC) نوع خاصی از کروماتوگرافی مایع است که به سبب مزیت‌­های فراوانی که دارد، به وفور مورد استفاده قرار می‌­گیرد. فاز ساکن در HPLC همواره جامد و فاز متحرک مایع است. از آن جا که فاز مایع، نمونه یا آنالیت را در خود حل می‌­کند، به عنوان حلال (solvent) نیز شناخته می­‌شود. در HPLC، فاز مایع از یک حلال به تنهایی یا هم‌­زمان از دو یا چند حلال با نسبتی معین تشکیل می­‌شود. قبل از ورود حلال به سیستم، آن را گاززدایی می‌­کنند. تزریق فاز متحرکِ مایع یا حلال توسط پمپ یا پمپ‌­هایی انجام می‌­شود که وظیفه تأمین فشار مایع را نیز بر عهده دارند. پس از برقراری جریان فاز متحرک در سیستم کروماتوگرافی، نمونه یا آنالیت از طریق سیستم تزریق (injector) به مسیر فاز متحرک تزریق می­‌شود.

ستون (column) کروماتوگرافی به منزله قلب دستگاه است که وظیفه اصلی جداسازی اجزای آنالیت را بر عهده دارد. مکانیسم جذب فاز متحرک به فاز ساکن انواعی دارد که بر همین اساس انواعی از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا وجود دارد: کروماتوگرافی جذبی، کروماتوگرافی تبادل یونی و کروماتوگرافی اندازه‌­ای. در کروماتوگرافی جذبی (adsorption chromatography) فاز ساکن و متحرک دچار جذب و واجذب‌­های متوالی می‌­شوند که خود به دو بخش کوچک­تر تقسیم می­‌شود: کروماتوگرافی فاز نرمال و کروماتوگرافی فاز معکوس.

پس از فرایند جداسازی در ستون کروماتوگرافی، اجزا به تفکیک از ستون خارج شده و به آشکارساز (detector) می رسند. انواعی از آشکارسازها وجود دارد که هر یک مزایا و معایب خاص خود را دارند و گروهی معین از ترکیبات را آشکار می‌­کنند. انتخاب آشکارساز بر اساس نمونه مورد آنالیز صورت می‌­گیرد. امکان استفاده از طیف­‌سنج جرمی نیز به عنوان آشکار وجود دارد. طیف حاصل از کروماتوگرافی در HPLC با دیگر روش‌­های کروماتوگرافی تفاوتی نداشته و همان نمودار سیگنالِ آشکارساز بر حسب زمان است که کروماتوگرام نامیده می‌­شود.

روش HPLC کاربردهای فوق‌­العاده فراوانی دارد که از آن میان می­‌توان به آنالیز کیفی و کمی دقیق مواد زیستی، محصولات پزشکی، محصولات غذایی، نمونه های محیطی (environmental)، محصولات سنتزی آلی و... که دامنه گسترده‌­ای از مواد را در بر می‌­گیرد، اشاره کرد.




کروماتوگرافی مایع

کروماتوگرافی (chromatography) تکنیکی برای جداسازی (separation) و خالص‌­سازی مخلوط‌­هاست؛ اما عمدتاً برای تعیین ترکیب شیمیایی یک نمونه (آنالیت، analyte) و شناسایی اجزای آن به کار می‌رود. این روش دقت بالایی داشته و کاربرد فراوانی در زمینه‌­های مختلف (نظیر مهندسی، پزشکی، کشاورزی و...) دارد.

اساس این روش، وجود تفاوت در میزان تمایل گونه‌­ها در جذب سطحی (adsorption) است. به این ترتیب که یک فاز متحرک (mobile phase) (گاز یا مایع) به عنوان یک حامل (carrier phase)، آنالیت را حمل کرده و از مجاورت یک فاز ساکن (stationary phase) (جامد یا مایع) عبور می­‌دهد. اجزای آنالیت، هم­چنان که در حال عبور از فاز ساکن هستند، به فاز ساکن، جذبِ سطحی می­‌شوند که در نتیجه آن، سرعت حرکت آن­ها کُند می‌­شود. هر یک از اجزا، تمایل مشخصی به فاز ساکن دارد؛ بنابراین، جزئی که مقدار بیشتری به فاز ساکن جذب شود، کندترین حرکت را در بین اجزا خواهد داشت. اگر عبور فاز متحرک از مجاورت فاز ساکن در یک فاصله به اندازه کافی طولانی انجام گیرد، به مرور زمان، اجزای آنالیت از یکدیگر جدا می­‌شوند؛ بنابراین، جزئی که کمترین تمایل را به جذب سطحی داشته باشد، اولین جزئی است که به پایان مسیر می‌­رسد، (شکل (1)) [1، 2].

شکل 1. فاز ساکن (سفید) و فاز متحرک (آبی و قرمز) در کروماتوگرافی.

 

اصطلاح کروماتوگرافی مایع (liquid chromatography) در حالتی که فاز متحرک مایع باشد، به کار می‌­رود. در کروماتوگرافی مایع فاز ساکن می‌تواند جامد یا مایع باشد. برای آشنایی بیشتر با اصول اولیه روش کروماتوگرافی و اجزای دستگاه کروماتوگرافی و عملکرد آن‌ها به نوشتار کروماتوگرافی گازی (GC) و کروماتوگرافی گازی-طیف سنجی جرمی (GC-MS) مراجعه نمایید.

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (high pressure liquid chromatography, HPLC) نوع خاصی از کروماتوگرافی مایع است که به سبب مزیت­‌های فراوانی که دارد، به وفور مورد استفاده قرار می­‌گیرد. به سبب استفاده از فاز مایع با فشار بالا، در گذشته نام کروماتوگرافی فشار بالا (high pressure liquid chromatography, HPLC) به آن اطلاق می‌­شده است. از جمله مزیت­‌های کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) نسبت به کروماتوگرافی گازی (GC)، سادگی در آماده‌­سازی نمونه و دمای کاریِ پایین­‌تر است. بدین ترتیب نمونه­‌های آسیب‌­پذیر در برابر دما مانند نمونه­‌های بیولوژیکی و هم­چنین  نمونه‌­های غیرفرار (non-volatile) به خوبی توسط HPLC قابلیت آنالیز دارند. مزیت HPLC نسبت به کروماتوگرافی مایع، سرعت، بازده و حساسیت بالاتر آن است. لازم به ذکر است که فاز ساکن در HPLC همواره جامد است [3]. اجزای دستگاه HPLC در شکل (2) به صورت شماتیک قابل مشاهده است.

 

شکل 2. شماتیکی از اجزای دستگاه HPLC [4].

از آن جا که فاز متحرک مایع، نمونه یا آنالیت را در خود حل می­‌کند، به عنوان حلال (solvent) نیز شناخته می­‌شود. در HPLC، فاز مایع از یک حلال به تنهایی (isocratic elution) یا هم‌­زمان از دو یا چند حلال با نسبتی معین (gradient elution) تشکیل می‌­شود که به نوع آنالیت وابسته است. معمولاً در نمونه‌­های پیچیده‌­تر، ترکیب حلال را طبق یک برنامه کنترل‌­شده (به صورت پیوسته یا پله‌­ای) تغییر می‌دهند. حلال­‌ها در محفظه‌­هایی از جنس شیشه یا فولاد زنگ‌­نزن (stainless steel) نگهداری می­‌شود. در ادامه انواع حلال­‌ها را مورد بررسی قرار خواهیم داد.

قبل از ورود حلال به سیستم، آن را گاززدایی (degassing) می­‌کنند زیرا ورود حباب به سیستم کروماتوگرافی، موجب ایجاد خطا در نتایج خواهد شد. پس از گاززدایی، حلال را از فیلتر عبور می­‌دهند تا از ورود ذرات جامد احتمالی نیز جلوگیری شود. به طورکلی، در کروماتوگرافی، خلوص فاز متحرک یا حامل (گاز یا مایع) از اهمیت ویژه‌­ای برخوردار است [1، 2].

تزریق فاز متحرکِ مایع یا حلال توسط پمپ یا پمپ­‌هایی انجام می­‌شود که وظیفه تأمین فشار مایع را نیز بر عهده دارند. جریان ایجاد شده باید پایدار و ثابت باقی بماند. فشار کاری سیستم در حدود 500-6000 psi و جریان در محدوده 0.1-10 mL/min است. انواعی از پمپ­‌ها در HPLC مورد استفاده قرار می‌­گیرند که در دو حالت جریان ثابت (constant flow) یا فشار ثابت (constant pressure) سرویس‌­دهی می­‌کنند. میزان جریان، فشار و اختلاط حلال­‌ها در پمپ‌­ها، توسط سیستم‌­های کنترلی به صورت دقیق مدیریت می­‌شوند.

پس از برقراری جریان فاز متحرک در سیستم کروماتوگرافی، نمونه یا آنالیت از طریق سیستم تزریق (injector) به مسیر فاز متحرک تزریق می­‌شود. سیستم تزریق معمولاً دارای یک حلقه ثابت (fixed-loop) است که نمونه توسط سرنگ در آن تخلیه شده و حلقه، کسری از نمونه را در خود جای می­‌دهد. با چرخش حلقه، نمونه در مسیر فاز متحرک قرار گرفته و وارد آن می­‌شود. سیستم­‌های تزریق قابل کنترلی نیز وجود دارند که به صورت خودکار کار می‌­کنند. سیستم تزریق، مقدار نمونه تزریق شده را تعیین می‌­کند [2، 3].

ستون (column) کروماتوگرافی به منزله قلب دستگاه است که وظیفه اصلی جداسازی اجزای آنالیت را بر عهده دارد. ستون­‌های به کار رفته در HP-LC عموماً لوله­‌هایی از جنس فولاد زنگ‌­نزن با قطر 2-5 میلی متر و طول 5-30 سانتی­‌متر هستند که تحمل فشارهایی به بزرگی 10000 psi را دارند. این ستون­‌ها از نوع پُرشده (packed) هستند و ذرات متخلخلی به بزرگی 2-10 میکرون درون آن‌­ها را پُر کرده است که نقش فاز ساکن را ایفا می­‌کنند. در برخی از دستگاه­‌ها قبل از ستون اصلی، یک پیسستون (pre-column) قرار دارد که وظیفه آن تمیز کردن سیال بوده و به منزله حفاظی برای ستون اصلی به شمار می­‌رود. از آن جا که دمای فرایند باید معین باشد، دمای ستون را توسط روش‌­هایی مانند حمام آب گرم (water bath) کنترل می­‌کنند.

همان‌طور که پیش‌­تر ذکر شد، آنالیت به فاز ساکن درون ستون جذب شده و فرایند جداسازی صورت می­‌گیرد؛ اما مکانیسم جذب فاز متحرک به فاز ساکن انواعی دارد که بر همین اساس انواعی از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا وجود دارد که عبارتند از: کروماتوگرافی جذبی، کروماتوگرافی تبادل یونی و کروماتوگرافی اندازه‌­ای.

در کروماتوگرافی جذبی (adsorption chromatography) فاز ساکن و متحرک دچار جذب و واجذب­‌های متوالی می‌شوند که خود به دو بخش کوچک‌­تر تقسیم می­‌شود [1، 3]:

  • کروماتوگرافی فاز نرمال (normal phase): در این حالت، فاز ساکن، قطبی (high polarity) (مانند سیلیکا SiO­2 و یا آلومینا Al2O3) و فاز متحرک، غیرقطبی (low polarity) (مانند هگزان و هپتان) به همراه مقدار کمی از حلال­‌های قطبی (مانند متانول، اتانول) است. به عبارت دیگر، فاز ساکن از فاز متحرک قطبی‌­تر است. در این حالت، برهمکنش‌­های قطبی آنالیت با فاز ساکن، معیار جذب خواهد بود. در نتیجه ترکیبی که تمایل بیشتری به فاز ساکنِ قطبی داشته باشد، دیرتر از ستون خارج می‌­شود.
  • کروماتوگرافی فاز معکوس (reverse phase, RPLC): این حالت برعکس فاز نرمال است. در واقع، فاز ساکن، غیرقطبی (مانند هیدروکربن های غیر قطبی C18، C8) و فاز متحرک، قطبی (مانند آب-اتانول) است. معمول­‌ترین نوع HPLC، روش فاز معکوس است. در این حالت، برهمکنش‌­های غیرقطبی آنالیت با فاز ساکن (برهمکنش‌­های واندروالس یا آ ب­‌گریز) معیار جذب خواهد بود، (شکل (3)).

 

شکل 3. برهمکنش فاز متحرک و ثابت در کروماتوگرافی فاز نرمال [5].

کروماتوگرافی تبادل یونی (ion exchange): در این نوع كروماتوگرافي از مكانيسم تبادل يوني براي جداسازي آناليت‌ها بر‌اساس بار آن‌ها استفاده مي‌شود. در این حالت هر جزء باردار آنالیت به بار مخالف خود در فاز ساکن جذب می‌­شود. این روش فقط برای جداسازی نمونه‌­های یونی به کار می­‌رود. فاز متحرکِ به کار رفته در کروماتوگرافی تبادل یونی یک بافر با pH و قدرت یونی (ionic strength) کنترل شده است، (شکل (4)) [1، 2].

 

شکل 4. برهمکنش فاز متحرک و ثابت در کروماتوگرافی تبادل یونی [5].

کروماتوگرافی اندازه‌­ای (size exclusion, SEC): در این حالت، فاز ساکن دارای تخلخل‌­هایی با اندازه‌­های کاملاً معین است. ملکول‌­ها و اجزای آنالیت وارد این تخلخل‌­ها شده و درون آن­ها باقی می­‌مانند. به عبارت دیگر، هر چه اندازه ملکلول کوچک­تر باشد، بیشتر در تله تخلخل‌­ها باقی مانده و دیرتر از ستون خارج می‌­شود. این روش، قدرت تفکیک بالایی ندارد و بیشتر به منظور خالص‌­سازی استفاده می‌­شود، (شکل (5)).

 

شکل 5. کروماتوگرافی اندازه‌ای [5].

پس از فرایند جداسازی در ستون، اجزا به تفکیک از ستون خارج شده و به آشکارساز (detector) می­‌رسند. انواعی از آشکارسازها وجود دارند که برخی از آن­‌ها عبارتند از: آشکارساز UV-Vis (Ultraviolet/visible absorption spectrophotometer)، آشکارساز فلورسنت (fluorescence detector)، آشکارساز ضریب‌شکست (refractive index detector, RI)، آشکارساز رسانایی (conductivity detector)، آشکار ساز الکتروشیمایی (electrochemical detector)، آشکارساز دیودی (diode array spectrophotometer.) و طیف­‌سنج جرمی (Mass spectrometer). هر یک از آشکارسازها بر اساس پدیده‌­ای منحصر به فرد، فرایند آشکارسازی را انجام می‌­دهند. در نتیجه هر یک مزایا و معایب خاص خود را داشته و گروهی معین از ترکیبات را آشکار می­‌کنند. با توجه به اینکه آشکارساز چه خاصیتی از ماده را دنبال می‌­کند، آشکارسازها به دو دسته کلی آشکارساز توده‌­ای (bulk detector) و آشکارساز ِخاصیتی (property detector) تقسیم­‌بندی می­‌شوند. آشکارساز توده‌­ای خاصیتی از کل فاز متحرک مانند رسانایی، ضریب شکست یا ثابت دی‌­الکتریک را بررسی می‌­کند. آشکارسازِ خاصیتی، ویژگیِ خاصی از اجزای نمونه مانند رفتار فلورسنت، جذب پرتو مادون قرمز و... را بررسی می­‌کند، (شکل (6)) [2، 3].

آشکارساز فلورسنت برای ترکیباتی که فلورسنت هستند کاربرد دارد. یک لامپ جیوه (mercury) یا زنون (xenon)، تابش فلورسنت را فراهم کرده و به نمونه تابانده می‌­شود. تابش فلورسنت پس از عبور از نمونه به یک آشکارساز فوتوالکتریک رسیده و ثبت می‌­شود. آشکارساز فلورسنت حساسیت بالایی دارد، اما همه ترکیبات خاصیت فلورسنت ندارند.

آشکارساز رسانایی، میزان رسانایی (conductivity) ترکیب را اندازه‌­گیری کرده و ثبت می‌­کند که معمولاً به همراه کروماتوگرافی تبادل یونی استفاده می‌­شود. در آشکارساز الکتروشیمیایی جریان الکتریکی تولید شده در اثر اکسایش (oxidation) یا احیای (reduction) نمونه اندازه‌­گیری و ثبت می­‌شود. به کارگیری آن راحت است و دقت بالایی دارد اما لازم است فاز متحرک رسانا و فاقد اکسیژن باشد [1، 2].

 

 

 

 

شکل 6. شماتیکی از کارکرد سه آشکارساز (بالا) UV-Vis (وسط) فلورسنت (پایین) ضریب شکست [5].

 

انتخاب آشکارساز بر اساس نمونه مورد آنالیز صورت می‌­گیرد. امکان استفاده از طیف‌­سنج جرمی به عنوان آشکارساز نیز وجود دارد. گاهی از دو آشکارساز به صورت سری استفاده می­‌شود. در این صورت مزایای آشکارسازها یکدیگر را تقویت کرده و نتایج دقیق­‌تری ارائه می­‌دهند. از جمله این روش­‌ها می­‌توان به موارد زیر اشاره کرد:

  • Liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS
  • Liquid chromatography-mass spectrometry-mass spectrometry, LC-MSMS
  • Liquid chromatography-infrared spectroscopy, LC-IR
  • Liquid chromatography-nuclear magnetic resonance, LCNMR

طیف حاصل از کروماتوگرافی در HPLC با دیگر روش­‌های کروماتوگرافی تفاوتی ندارد و همان نمودار سیگنال آشکارساز بر حسب زمان است که کروماتوگرام (chromatogram) نامیده می‌شود، (شکل (7)).

 

شکل 7. نمودار سیگنال آشکارساز بر حسب زمان (کروماتوگرام).

روش HPLC کاربردهای فوق‌­العاده فراوانی دارد که از آن میان می­‌توان به آنالیز کیفی و کمی دقیق مواد زیستی، محصولات پزشکی، محصولات غذایی، نمونه‌های محیطی (environmental)، محصولات سنتزی آلی و... اشاره کرد که طیف گسترده‌­ای از مواد را در بر می­‌گیرد، (شکل (8)).

 

شکل 8. گستره کاربرد HPLC در آنالیز مواد مختلف [6].

مراجع

[1] Stavros Kromidas, “The HPLC-MS Handbook for Practitioners [1 ed.]”, Wiley-VCH,      2017.

[2] Danilo Corradini, “Handbook of HPLC”, Second Edition, Chromatographic Science Series, CRC, 2010.

[3] Donald A Wellings,            “A Practical Handbook of Preparative HPLC”, Elsevier Science, 2006.

[4] “Introduction to High Performance Liquid Chromatography”, presentation by Aginlent Technologies.

[5] http://www.chem.tamu.edu/rgroup/gladysz/

[6] Tom Sirard, “Fundamentals of HPLC”, Waters Corporation, 2012.

به این محتوا امتیاز دهید

برای دوستانتان ارسال کنید

برای ثبت نظر ابتدا لاگین نمایید.

ما مشتاق دیدگاه شما هستیم.

مطالب پیشنهادی